Inledning

Syftet med nationella riktlinjer för ANA-diagnostik är att uppnå hög och likvärdig kvalitet över hela landet. I takt med att nya antigenspecificiteter och analysmetoder introduceras kan flera enskilda ANA-specificiteter numer bestämmas i rutindiagnostik. De nya metoderna uppvisar ofta hög sensitivitet och är inte helt jämförbara med tidigare metoder, vilket understryker behovet av gemensamma riktlinjer. Målet är också att resultat ska tolkas likvärdigt. ANA-diagnostik ingår som utredning vid misstanke om reumatisk systemsjukdom, juvenil idiopatisk artrit och autoimmun leversjukdom.

Anti-nukleära antikroppar (ANA) är en benämning som innefattar alla antikroppar som reagerar med cellkärnan. ANA kan påvisas immunmorfologiskt, vanligen med immunfluorescensmikroskopisk mönsterbedömning av HEp-2 cellernas kärna (IF-ANA) eller genom metodik som möjliggör analys av enskilda ANA-specificiteter. Benämningen ANA och IF-ANA är under diskussion och internationellt finns det många förespråkare som vill byta benämningen ANA till AC (Anti-Cell antikroppar) och IF-ANA till IF-HEp-2, för att inbegripa kliniskt signifikanta fynd av cytoplasmatisk fluorescens vid IF-ANA bedömning. I denna revision av riktlinjer har vi valt att behålla benämning IF-ANA syftande på cellkärnefluorescens och särskilja detta från cytoplasmatisk fluorescens.

För att veta vilken eller vilka antikroppsspecificiteter som orsakar IF-mönster med HEp-2 celler, och dessutom påvisa antikroppar mot antigen som inte uttrycks i tillräcklig mängd i testceller, behöver man använda metoder där enskilda antigen exponeras för antikroppar, och samlingsnamnet för dessa antikroppar är enskilda ANA-specificiteter. Anti-dsDNA (dubbelsträngat DNA) ingår i de enskilda ANA-specificiteterna, men på grund av metodikskillnader och något olika krav på specificitet kommer anti-dsDNA i vissa av nedanstående riktlinjer att presenteras separat från övriga enskilda ANA-specificiteter. Om det inte specificeras närmare ingår anti-dsDNA i benämningen enskilda ANA-specificiteter nedan.

Dessa riktlinjer är en revidering av tidigare version från 2020 och har utarbetats av expertgruppen inom EQUALIS. Riktlinjerna har granskats och justerats av kliniska immunologer med kompetens inom fältet vid universitetssjukhusen, och godkänts av styrelsen för Svensk Förening för Klinisk Immunologi och Transfusionsmedicin.

.

Riktlinjer

ANA generellt

• 1. Laboratorier som utför analys av antinukleära antikroppar (ANA) bör erbjuda screening med immunmorfologisk teknik, vanligen immunfluorescens (IF)-mikroskopi med HEp-2-celler eller motsvarande cellinjer som antigenkälla, och antikroppar mot enskilda ANA-specificiteter
• 2. Enligt punkt 1 bör vid screening av ANA både IF-ANA och analys av ett urval av enskilda ANA-specificiteter ingå. Om endast IF-ANA eller enskilda ANA-specificiteter har analyserats skall detta framgå av svarsrapporten. Kommentaren vid isolerad IF-ANA skall ge information om att enskilda ANA-specificiteter såsom främst SS-A60kDa (Ro60) och SS-A52kDa (Ro52) och Jo-1 kan missas. Om enbart enskilda ANA-specificiteter har analyserats vid ANA-screening, ska man informera om att metoden inte omfattar alla ANA som kan upptäckas med IF-mikroskopi
• 3. Typ av metodik för analys av ANA och enskilda ANA-specificiteter skall framgå i svarsrapporten.
• 4. Vid analys av ANA och enskilda ANA-specificiteter skall detektionsantikroppen vara IgG (gammakedje)-specifik så att enbart antikroppar av IgG-isotyp detekteras.
• 5. Laboratoriet skall delta i externa provningsjämförelser med sina analysmetoder för IF-ANA och enskilda ANA-specificiteter. Deltagande möjliggör kontroll av laboratoriets valda analysmetoders sensitivitet och specificitet jämfört med annan metodik som används av andra laboratorier. Det är också ett av flera sätt att kontrollera att man till exempel vid laboratoriets valda cut-off kan påvisa positivitet där sådan förväntas.
• 6. För alla ANA (AC) där internationella referenspreparationer finns tillgängliga skall laboratoriet kontrollera prestandan i sina valda analysmetoder för dessa.

IF-ANA med HEp-2

• 7. IF-ANA med HEp-2 eller motsvarande cellinjer som antigenkälla är standardmetod. IF-ANA ingår i klassifikationskriterierna för SLE, som prognostisk markör vid juvenil idiopatisk artrit (oligoartrit) och i diagnostiska kriterier för autoimmun leversjukdom.
• 8. De IF-ANA-mönster som ska rapporteras motsvarar i princip den basala nivån, ”competent level”, enligt International Consensus on ANA Patterns (ICAP, www.ANApatterns.org). De mönster som skall rapporteras är: homogent, kornigt, centromer, nukleolärt, kärnmembran, nukleära prickar, och cellcykelberoende/pleomorfa. ”Dense fine speckled 70” (DFS70) som ingår i ”competent level” kan som enda antikroppsfynd i enstaka fall vara av utredningsvärde och skall vid svarsrapportering av det mönstret alltid först verifieras med antigenspecifik metod. Flera av övriga mönster enligt ”competent level” kan också av värde att identifiera mer i detalj enligt ”expert level” och ibland åtföljas av rekommendation att analysera vidare med antigenspecifik metod, där sådan finns tillgänglig. Exempelvis har fynd av nukleära prickar av mönster ”multiple” eller ”few” helt olika diagnostisk association. Via https://asc.dental.ufl.edu/reference-sera/ kan laboratorier beställa referensmaterial för många ANA (AC) framtaget av IUIS Autoantibody Standardization Committee (ASC) i samarbete med Centers for Disease Control (CDC), Dessa kan bland annat i sammanhang av HEp-2 mönster vara av värde för att se hur laboratoriets valda IF-metoder diskriminerar mellan olika antikroppsspecificiteter, och uppför sig som förväntat.
• 9.Vid cytoplasmatisk fluorescens av HEp-2 celler som inger misstanke om förekomst av kliniskt relevanta autoantikroppar såsom anti-mitokondrieantikroppar, antikroppar mot aktin eller misstanke om autoantikroppar associerade med myosit, interstitiell lungsjukdom eller SLE (anti-ribosomalt P) skall detta kommenteras i svaret.
• 10.IF-ANA bör besvaras semikvantitativt som t.ex. ”ej påvisbart”, ”påvisbart” resp. ”starkt påvisbart”, som en titer eller enhet.
• 11. Cut-off nivå för IF-ANA ska bestämmas av varje enskilt laboratorium. Lämpligen undersöks blodgivarsera från 100 kvinnor och 50-100 män. Vid vald cut-off blir ofta cirka 3-5% av normalmaterialet positivt. ANA förekommer oftare hos kvinnor än hos män, men av praktiska skäl används gemensam gräns. I hög ålder (>80 år) blir förekomsten av ANA lika hög hos män som hos kvinnor.

Anti-dsDNA

• 12. Nyupptäckt anti-dsDNA som påvisas med ELISA eller liknande metodik bör konfirmeras med Crithidia luciliae test, vanligast är immunfluorescens test (CLIFT). Positiv CLIFT har hög diagnostisk specificitet för SLE, men kan även ses vid autoimmun hepatit (AIH). Kvantifiering av anti-dsDNA kan däremot gärna utföras med annan metod. I de fall där anti-dsDNA är svagt positiv med annan metod, men ej kan verifieras med CLIFT bör detta alltid kommenteras. Vid påvisande av anti-dsDNA bör alltid en tolkningskommentar ges i svaret.
• 13. Anti-dsDNA skall kvantifieras eftersom serumnivån av dessa antikroppar kan spegla sjukdomsaktivitet vid SLE.
• 14. Vid analys av anti-dsDNA oavsett metod är det förväntade resultatet att samtliga normalsera blir negativa. Lämpligen analyseras blodgivarsera från 25 kvinnor och 25 män, dvs totalt minst 50 blodgivarsera. Vid CLIFT används en låg serumspädning (förslagsvis 1/10) vid screening. Även om det är mycket ovanligt skall man vara medveten om att låga serumspädningar är en faktor som kan öka risken för prozoneffekt.

Övriga enskilda ANA-specificiteter

• 15. I basalutredning skall, förutom anti-dsDNA, bland de enskilda ANA-specificiteterna även ingå minst följande enskilda specificiteter: SS-A60kDa (Ro60), SS-A52kDa (Ro52), SS-B, RNP (U1RNP), Sm, Jo-1 och Scl-70. Vid påvisande av enskild ANA-specificitet bör tolkningskommentar ges i svaret.
• 16. Laboratoriet skall ha en rutin för att kunna erbjuda analys av övriga enskilda ANA-specificiteter, precis som för anti-dsDNA, med annan metodik, då resultat ibland kan behöva verifieras.
• 17. För enskilda ANA-specificiteter, exklusive anti-dsDNA, bör högst 2% av normalmaterialet bli positivt. Lämpligen analyseras minst 50 blodgivarsera (förslagsvis från 25 kvinnor och 25 män).

Referenser

American College of Rheumatology Position Statement: Methodology of Testing for Antinuclear Antibodies 2019.

Bizarro N. Can solid-phase assays replace immunofluorescence for ANA screening? Ann Rheum. Dis 2020. 79(3):e32.

Bossuyt X et al Antinuclear antibodies by indirect immunofluorescence and solid phase assays. Ann Rheum Dis. 2019. 79(6):e65.

Carolis SD et al. Autoimmune Congenital Heart Block: A Review of Biomarkers and Management of Pregnancy. Front Pediatr. 2020. 8: 607515.

Chan EKL et al. The International Consensus on ANA Patterns (ICAP) in 2021—The 6th Workshop and Current Perspectives. J Appl Lab Med. 2022. 7(1): 322-330.

Claessens J et al. Solid phase assays versus automated indirect immunofluorescence for detection of antinuclear antibodies. Autoimmun Rev. 2018 Jun;17(6):533-540.

Dahle C et al. Methods of choice for diagnostic antinuclear antibody (ANA) screening: benefit of adding antigen-specific assays to immunofluorescence microscopy. J Autoimm 2004;22(3):241-8.

Damoiseaux J et al. Autoantibodies to dsDNA in the diagnosis, classification and follow-up of patients with systemic lupus erythematosus 2023 J Transl Autoimmun. 2023; 6: 100191.

Damoiseaux J et al. Clinical relevance of HEp-2 indirect immunofluorescent patterns: the International Consensus on ANA patterns (ICAP) perspective. Ann Rheum Dis 2019;879-889.

Damoiseaux J, et al. International consensus on ANA patterns (ICAP): the bumpy road towards a consensus on reporting ANA results. Autoimmun Highlights 2016, 7(1):1.

Enocsson H et al. Four anti-dsDNA antibody assays in relation to systemic lupus erythematosus disease specificity and activity. J of Rheumatology 2015. 42:817-25.

Huang Y-Q. Recent advances in the diagnosis and treatment of primary biliary cholangitis. World J Hepatol 2016.8(33):1419-41. 2015. 3(1):42-52.

Liberal R et al. Update on Autoimmune Hepatitis. J Clin Transl Hepatol. J Clin Transl Hepatol. 2015. 3(1): 42–52.

Lundberg IE et al. Idiopathic inflammatory myopathies. Nat Rev Dis Primers. 2021. 7(1):86.

Nilsson B et al. Antinuclear antibodies in the oldest-old women and men. J Autoimmun. 2006 Dec;27(4):281-8.

Ravelli A et al. Antinuclear antibody-positive patients should be grouped as a separate category in the classification of juvenile idiopathic arthritis. Arthritis Rheum 2011. 63(1):267-75.

Rönnelid J et al . The choice of laboratory methodology influences autoantibody test results. Frontiers in Immunology. 2015. 6:392.

Theodorsson E et al. Klinisk kemi 2018, Studentlitteratur, kap 5.

Truedsson L et al. Klinisk Immunologi 2012, Studentlitteratur, kap 13.

von Muhlen CA et al. How to report the antinuclear antibodies (anti-cell antibodies) test on HEp-2 cells: guidelines from the ICAP initiative. Immunol Res. 2021. 69. 594-608.